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BCA蛋白定量試劑盒的使用方法和注意事項

發布日期: 2022-11-12
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   BCA蛋白定量試劑盒是根據目前世界上常用的兩種蛋白濃度檢測方法之一——BCA(bicinchoninicacid)法研制而成,實現了對蛋白質進行快速、穩定、靈敏的濃度測定。本試劑盒的原理是蛋白質分子中的肽鍵結構在堿性環境下能與Cu2+絡合生成絡合物,將Cu2+還原成Cu+,而BCA試劑可敏感特異地與Cu+結合,形成穩定的有顏色的復合物,并在562nm處有光吸收峰值,該復合物顏色深淺與蛋白質濃度成正比,可根據吸收值的大小來測定蛋白質的含量。1h內即可完成蛋白質定量檢測。本試劑盒含有牛血清白蛋白(BSA)溶液作為蛋白質標準溶液,測定范圍為20-2000µg/ml。
 
  使用方法
 
  1.融化蛋白標準品,取適量蛋白標準品稀釋至終濃度為0.5mg/mL。蛋白樣品使用什么溶液溶解,標準品也應用什么溶液稀釋,但是為了簡便起見,也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標準品。將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的標準品孔中,加標準品稀釋液補足到20μL,相當于標準品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。
 
  2.根據樣品數量,按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液,充分混勻。例如5mLBCA試劑A加100μLBCA試劑B,混勻,配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室溫24h內穩定。
 
  3.加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中,也加稀釋液到20μL。
 
  4.各孔加入200μLBCA工作液,37℃放置20~30min。也可以室溫放置2h,或60℃放置30min。
 
  5.測定A562吸光值,540~595nm之間的波長也可接受。根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。
 
  注意事項
 
  1.蛋白標準品配制后可立即使用,也可以-20℃長期保存。
 
  2.BCA法測定蛋白濃度時,顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低,適合在較高溫度孵育或適當延長孵育時間以獲得更好檢測效果。
 
  3.因為延長孵育時間會引起吸光值的變化,所以在用紫外分光光度計檢測時,應盡可能加快檢測速度,以免先檢后檢產生系統誤差。
 
  4.標準蛋白液的加量應當準確,如果加量不準確,會導致制作出來的標準曲線出現偏差,影響待測樣品的濃度計算,所以一方面需要用梯度稀釋的方法來配置標準蛋白液,另一方面應使用精確度高的移液槍。
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